我们证明了PLP和RCA的高特异性和多重检验测试能力，用于经济的数字量化读数使这项检测更接近临床应用。
人类进入工业化时代以来，战争历来都是血流漂杵的惨剧，但是在一百年前的1918年，一个游荡于地球上的恶魔却使得空前惨烈的第一次世界大战在它面前都相形见绌。这个恶魔就是时至今日仍让人闻之色变的西班牙流感。
1918年的流感大流行堪称人类历史上最为惨痛的记忆，小小的流感病毒造成了5000多万人死亡，甚至超过了第一次世界大战死亡人数的总和。由于各交战国都深受西班牙流感之害，因此不得不鸣金收兵，残酷的战争机器在瘟疫面前戛然而止。
100年来，科学技术突飞猛进，天花、脊髓灰质炎、麻疹……一个个曾经肆虐的人类杀手纷纷淡出了人们的视野，人类曾经以为传染病这个天敌被永远征服了。孰料近年来新的流感毒株卷土重来，一次次造成公共卫生危机，2018年年初疯传朋友圈的《流感下的北京中年》一文更是提示警醒我们，流感这个恶魔一直在游荡...... 据卫生部官网网站发布的消息，今年的流感防控形势不容乐观，凛冬将至……（原文发布于2019年）
在世界范围内流感对健康仍然具有持续的威胁，据世界卫生组织估计，每个季节流感影响全球5%至15%的人口，造成300至500万例严重病例和近50万人死亡。为降低流感的发病率并减轻济负担，人类需要改进诊断试验。
魔高一尺，道高一丈。金宝觉得，对我们检验工作者来说，兵来将挡水来土掩才是正道。虽然流感新毒株层出不穷，但是在我们检验界日新月异的新技术面前仍然无所遁形。
今天金宝就给大家介绍一种基于锁式探针和滚环扩增技术建立一种季节性流感多重检测和分型方法。
该试验同时针对4种流感变体（H1N1）、A（H3N2）、B/Yamagata和B/ victoria的全部8个基因组片段，并与一种经济型数字量化原型试剂盒结合。采用具有特征的病毒毒株和患者鼻咽拭子做多元化的分析设计和分析确认。通过对接受商用流感试验（Simplexa™ Flu A/B & RSV Direct）平行分析的50份临床样品进行盲法检测评估诊断性能。
该方法检验测试限为18个病毒RNA拷贝，对季节性循环流感变异体的鉴别检测和分型具有100%的分析特异性和临床特异性。50份临床样品检测流感的诊断灵敏度为77.5%，对季节性流感变异体的分型灵敏度为73%。研究者提出了一个经过概念验证的结合锁式探针试验与经济型数字阅读技术对季节性甲型流感和乙型流感尽心检测和分型的方法。研究者证明该方法具有高特异性和多重检验测试能力，通过与数字定量技术相结合，确认了一种很有前景的季节性流感检测和诊断方法。
金宝查阅了世界卫生组织的有关数据，每年流感的季节性爆发在全球造成全球300万至500万人严重感染。根据欧盟的统计结果，每年欧盟的登记的病例约为160万例，这中间还包括5万住院病例和3万死亡病例。2009年甲型H1N1流感在全球造成近30万人死亡。这些数字表明需要快速和准确的诊断试验，以检测和监测季节性流感和广泛流行性流感。
流感属于正粘病毒科，该病毒科有3个属可以感染人类：甲型、乙型和丙型流感病毒。甲型和乙型流感病毒传统意义上的流感，而丙型流感病毒只能引起轻度上呼吸道感染。目前流行的季节性甲型流感乙型流感各有2个亚型，分别为甲型（H1N1）、甲型（H3N2）、乙型/Yamagata和乙型/Victoria。流感基因组由8个线性反义单链RNA片段编码的10种蛋白质组成。
与其他RNA病毒一样，流感病毒基因组复制是一个容易出错的过程，该过程导致了持续进化（遗传漂变）和具有抗原特异性的菌株的连续替换。当来自不一样的物种的流感病毒（通常是人类、猪和/或水禽）感染同一宿主，导致新的病毒基因型重组和出现时，具有广泛流行性流行的流感就非常有可能发生。这些进化过程使流感分子诊断试验的开发具有挑战性，因为目标基因序列的突变可能会引起假阴性试验结果。
现代流感诊断以核算检验测试为主，由于其具有敏感性和特异性高、周转时间短等特点，所以取代了病毒分离和免疫检测。因此，现有的一些商业诊断流感诊断的系统中，大多数是基于实时PCR技术。
由于流感的遗传变异和漂移，基于PCR的试验需要持续的检测确认和偶尔的优化（例如引物设计和温度选择），以可靠地检测所有相关的新型流感变异。在这方面，下一代测序技术能提供克服这些限制的手段；然而，虽然最近有了一些进展，但是它们在临床环境中的应用仍然具有挑战性，仍然需要高度浓缩和纯化的核酸，因此就需要对目标进行富集和/或预扩增，达到这一目的通常使用PCR。
锁式探针（PLP）是一种通过结扎并以严格依赖目标的方式循环的线性寡核苷酸。它们与滚环扩增（RCA）相结合，发展成为具有高度多重性特点并可用于诊断目的特殊生物分析试验。RCA通过等温复制环状DNA模板产生长单链DNA串联体。这些RCA产物（RCP）是可以在均相溶液中进行数字量化的亚微米大小的分子，因此与其他等温扩增试验（如环介导的等温扩增和螺旋酶依赖性扩增）相比有着非常明显的优势。有使用PLP/RCA检测病毒、细菌和真菌的报道。
环对环扩增（C2CA）是一种更进一步的发展，在这种发展中，连续执行多轮次RCA以获得更高的灵敏度。C2CA是一种低变异系数（CV）、低扩增偏差的方法，非常适合于具有高度多重性的方式。对于流感病毒的检测，利用PLP/RCA的研究已经为诊断系统的开发奠定了基础，但是还没有在临床环境中来测试。例如，Gyarmati等人将RCA技术与常规PCR扩增结合，对禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶片段进行了鉴别。近年来，Dou等人利用原位PLP法标记甲型流感病毒基因组，研究其分子发病机制。除此之外，没有研究直接利用PLP/RCA在流感诊断方面的潜力。
本文中，研究者证明了基于PLP/C2CA的流感诊断试验的概念，并评估了诊断性能。为此，研究者设计了针对季节性流感4个传播亚型的所有8个基因组片段保守区域的PLP。
在金宝看来，本设计旨在提升灵敏度、突变耐受性、检测新兴菌株及分型的能力。此外，研究者还采用了一种基于新开发的微流体RCP富集（MRE）技术的原型试剂盒读取器，这种技术不需要专门的仪器就能够直接进行数字量化。研究者优化并演示了用病毒培养毒株和鼻咽患者样本做分析的能力。最后，通过对50例临床鼻咽患者样本的盲法检测，评估了流感检测和分型的诊断性能。金宝在下文中将就该方法为您进行详细地阐述。
2016 - 2017年期间在瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡大学医院采集患者鼻咽样本（n = 65），作为呼吸道病毒感染常规诊断的一部分。其中15份样品用于试验开发，50份样品用于试验确认。
患者样本信息见表1，患者样本信息见在线。使用sterile Dacron/nylon棉棒采集样品，在进一步处理前，样品储存在4℃的包含病毒运输介质的试管中。样品的使用得到了斯德哥尔摩当地伦理审查委员会的批准。
在根据制造商的说明采集样品后，使用Simplexa Flu A/B & RSV Direct Kit （Focus Diagnostics）执行甲型流感、乙型流感和呼吸道合胞病毒的常规诊断。使用得到认可的室内实时PCR检测下列13种病毒：腺病毒、博卡病毒、冠状病毒 NL63/OC43/229E/HKU1、肠病毒、偏肺病毒、副流感病毒1-3和鼻病毒。对上述病毒的RNA的提取进行优化和确认。
a由Simplexa试验确定流感亚型和CT值。逆转录C2CA试验的RCP计数显示为MRE定量副本的平均值。计算的检测限为18RCP（n=3）
针对选定的流感亚型基因组片段，设计了具有特异性条码的逆转录引物和检测用PLP（见在线）。使用默认设置的ClustalW执行多序列对齐，在每个基因组片段上选择大约40 bp长的高度保守的区域。
随后，利用MegaB- LAST （nBLAST，NCBI；访问日期：2016年7月5日）确认这些保守区域、覆盖范围和特异性。重复这一过程获得报告的相应流感病毒亚型序列≥99%覆盖范围。Victoria 和Yamagata 毒株有6个一般区域，PLP被设计为标定误配。因此设计了26个逆转录引物和32个PLP。PLP包括（a）靶标在5和3端（arms）的互补序列，（b）限制性寡核苷酸（RO）序列的主链，以及（c）泛流感和亚型特异性条码（图1，a和c）。
图1. 锁式谈着混合物和试验设计（A）PLP设计。一般和亚型也乙型条码支持一般流感病毒检测和亚型分型。（B）逆转录和捕获粒子（1）PLP杂交和结扎；（2）次一次RCA反应；（3）后续限制消化；（4）第二轮结扎和扩增；（5）标签和RCP检测。（C）双标签方案。TR，德克萨斯红；AF750，Alex荧光剂750；Cy5，青色素5；AF488；Alex荧光剂488；Cy3，青色素3
生物素化互补DNA （cDNA）是从细胞培养毒株和储存的鼻咽拭子标本中提取的病毒RNA （vRNA）逆转录产生的。为此，100 nmol / L 5 生物素修饰引物和500µmol / L dNTP与vRNA混合，在65°C预热5分钟并快速冷却。之后，添加100mU/µL RNase抑制剂，250mU/µL转录物逆转录酶和逆转录缓冲液。以55°C的温度执行逆转录10分钟，随后对总量为20µL的混合物以85℃的温度进行5分钟的热失活。
为了对引物和探针进行优化，利用专用仪器Aquila400（Q-linea AB）进行扩增单分子检测（ASMD）定量RCP。MRE采用定制的原型微流体芯片，设计图见在线。
这个即用型原型芯片包括嵌入3毫米直径硝化纤维素膜的10个通道与（图2，A和B）与一个对应于10倍显微镜视场的直径1.5毫米的活跃表面。使用注射泵操作MRE卡盒，该注射泵能对100μL的样品进行摄取和添加并进行5μL/分钟的富集。MRE卡盒操作说明见图2A。
由于AF488通道内硝化纤维素膜具有较高的自体发光性，限制了与Yamagata亚型条码相对应的RCP的定量（见在线）。因此，对Yamagata的分型是基于检测常规条码和其他亚类型通道中信号的缺失（图2C）。
为了进行荧光成像（图2 B），使用Axioplan 2荧光显微镜数字化（Zeiss）显微镜在10倍视场下获得10焦点平面图像，随后采用CellProfiler软件分析RCP信号。简而言之，CellProfiler管道包含图像增强和每个荧光通道的人工阈值确定步骤。
统计分析采用R软件对单个荧光通道的RCP计数做多元化的分析和解释。简而言之，根据共同条码通道的初始定义阈值，将患者分为流感阳性和流感阴性。采用通道特异性阈值进一步对生成阳性的样本做分类，管道的自动分析见图2C的图示。
图2.微流体富集、打码原则和诊断算法流程图（A）原型MRE模块操作说明：（1）插件；（2）泵；（3）条带；（4）图像。（B）基于MRE，使用5中不同荧光团条码的流感检测和分型原则；此处以H3N2为例。测量条长20μm。（C）诊断算法流程图，自动成像、数据分析和RCP分析。TR，德克萨斯红；AF750，Alex荧光剂750；Cy5，青色素5；AF488；Alex荧光剂488；Cy3，青色素3
PLP设计包括32个靶向4种流行流感亚型8个基因组片段约40 bp长的保守区域的PLP（图1A）。这种方法有着非常强的流感检验测试能力，因为它能容许基因漂移和单个基因突变等事件。实验工作流程如图1B所示。简而言之，从细胞培养物和鼻咽拭子中提取的vRNA通过生物素化引物混合物进行逆转录反应。生物素化cDNA与PLPs和连接酶的混合物混合，在目标识别时形成圆环。随后，加入链霉菌素包被的磁性粒子捕捉圆环并清洗多余的PLP。捕获的环被第一轮RCA扩增，结合粒子的RCP被使用限制性内切酶的单体化释放。RCP单体通过连接过量的RO而循环，同时被第二次RCA反应扩增。通过ASMD或MRE对产生的RCP进行荧光标记和定量。
对于MRE而言，研究者使用了定制的一次性微流体芯片，这是原始方法的改进版本。MRE芯片由一个10通道的硬聚合物芯片组成，具有高通量和即用的特点（图2A和在线）。对富集的RCP进行10倍放大（图2，A和B）并量化为数字信号。根据PLP中包含的通用流感条码和特定条码的自动解码进行分型识别RCP（图1、A、C、2C）。图2B以H3N2流感病毒的检测和分型作为范例。在这两个通道中相似的RCP计数和这些RCP的共定位确认了有效的双重标记，因此成功地鉴别了流感的亚型。
该方法的灵敏度和特异性经过了几个步骤的优化。首先，比较随机十倍体、特异引物，以及两者的组合进行逆转录反应。根据结果得出，特异性引物检测效率最高（见在线）。接下来，研究者评估每个子类型使用8个PLP取代每个子类型评估单个PLP（图3A）。8-PLP组合将灵敏度提高了大约1个数量级，线性动态范围同时扩展和允许检测到18个pg /µL的 cDNA。研究者还估计了通过对一个对毒株进行连续稀释检测18个RNA拷贝的检测限（见在线）。
使用通用条码时该分型策略被证实具有98%的特异性且具有最小的交叉反应性（见在线个PLPs的完全混合物从测序的参考菌株分析vRNA的性能。研究者使用通用条码检测所有亚型，来自亚型特异性条码的信号显示出100%特异性（图3B）。因此，双标签策略比普通条码更能提高准确率（见在线）。
研究者通过鼻咽样本进一步确认了该方法的有效性。为此，我们根据从高级至中级的病毒水平选择了15份流感阳性患者样本（CT，18.1-26.5），这中间还包括Simplexa Flu A/B & RSV Direct assay检测的12例甲型流感和3例乙型流感样本。对于每一个反应，使用2µL RNA提取物，仅进行常见的条形码的检测。MRE得到的结果详见表1，灵敏度为100%。CT值与RCP计数呈中度相关（r = 0.72，P =0.003；见在线A）。
研究者评估了对50份临床鼻咽患者样本的盲法检测的临床灵敏度和特异性（见在线份乙型流感病毒）和10份流感病毒阴性样本，其中对8份样本做了全面的其他呼吸道病毒测试。以Simplexa为金标的24份甲型流感样本的CT值介于20.8 - 31.1；16份乙型流感样本的CT值介于21.1 - 36.7。对这种的样本集，RNA的数量从2µL提高到10µL减少因吸取的样品体积小而引起的变化。
图4. 50份患者样品盲法检测逆转录C2CA分析的灵敏度和特异性（A）逆转录C2CA检测甲型和乙型流感结果的原始数据，Simplexa试验为金标。TP，真阳性；FN，假阴性；TN，真阴性；FP，假阳性。（B）逆转录C2CA结果的ROC分析（n=50）。AUC，曲线下面积。（C）包括所有荧光通道的试验性能旭日图。
研究者通过逆转录C2CA试验检测了24份甲型流感样本中的19份（79%）和16份乙型流感样本中的12份（75%）。10份流感病毒阴性样本的检测也呈阴性。RCP与CT值呈中度相关（r = 0.53， P = 0.002；在线B）。研究者进行了ROC分析（见在线），得到分析得到曲线，检测临床鼻咽标本内流感的最大灵敏度为100%，绝对特异性为77.5%（图4 A和B）。此外，研究者区分甲型流感和乙型流感的灵敏度为甲型流感73%，乙型流感67%（图4C和在线C。
流感的分子诊断学的发展面临的挑战之一是每个季节都一定会出现新的流感变种。因此，基于核酸检验测试的检测由于引物/探针不匹配，仅针对流感基因组中的一个区域，存在出现假阴性结果的风险。因为能克服这一限制，所以针对所有基因片段的策略有着非常明显优势。
在本研究中，研究者通过设计针对8个基因组片段保守区域的PLP，实现并检验了该策略的诊断潜力。除了提高鲁棒性，研究者的结果为，这种方法还将分析灵敏度提高了一个量级，允许检测到18个RNA拷贝。当使用32个PLP的混合物时，进一步证实了这一点。
该方法在不增加背景信号的情况下，检测所有4种流感亚型的特异性可达100%（图3B）。这些结果证明PLP在高度多重检测设计方面的优势。在这种情况下，最终能够针对每个基因片段的更多区域，包括不同的变异或其他相关的呼吸道感染，如RSV和肺炎链球菌。
图3. 细胞培养毒株和流感样品参考毒株的逆转录C2CA的分析性能（A）利用ASMD作为读取方法8-plex和1-plex的比较。误差条等于平均值的标准差（SD）（n=3）。绿色虚线代表检测限。（B）利用双标签以及32PLP结合MRE进行分型。在减去通道特异性检测限（n=2）后总RCP的分型百分比；检测限下的值设定为0。反应样品RCP计数的条件色编码以绿色显示。
此外，与数字PCR等平台不同，MRE卡盒的适应性使研究者能够以数字化的方式对亚型进行差异化分析，且不需要专门的商业仪器。尽管研究者受到荧光滤光片可用性的限制，但通过采用结合法定序化学或基于阵列的格式能增加分析的目标数量，这两种方法都可以识别亚型和用于检测新菌株片段的特异性信号。MRE模块的进一步改善可能是使用具有较低自体发光特性的替代膜或选不一样于硝化纤维素光谱发射的荧光团。
尽管存在局限性，但通过一系列分析50例患者的鼻咽拭子RNA提取物，研究者可以对32-PLP混合物的设计和MRE模块的临床诊断特性做评估。获得的临床特异性可与报告的RT-qPCR的特异性相比，灵敏度也在免疫分析的范围内（图4A，在线），在提供流感亚型信息方面具有更大的优势。分型性能表现为甲型流感为73%（11 H3N2， 3 H1N1），乙型流感为67%（4 Victoria，4 Yamagata）。Simplexa试验不能对甲型和乙型流感进行分型。
因此，无法在分型层次上进行ROC分析。然而，研究者的检测得到的亚型与2016年至2017年期间流行的流感亚型是一致的吗。有趣的是，研究者还发现和Simplexa试验得到的CT值与RCP技术之间有些许定量相关性（见在线），因此不考虑利用不一样的提取和逆转录方法，采用在不同时间点采集的样品的不同等份再进行这两种试验。
未来可能的工作包括关注常规和床旁护理应用程序的简易性以及提升灵敏度的方法。这包括采用直接检测RNA的方法来去除逆转录步骤，扩大每个基因组片段的PLP数量，或者仅仅通过增加富集RCP的体积。此外，本研究中使用的C2CA分析能够最终靠常规自动化工作站实现自动化，也能够使用已报告的微流体自动化策略或现有的商业解决方案（Aquila 1000， Q-linea AB）实现自动化。
总之，我们从临床鼻咽患者样本中提出了一种基于PLP的流感检测和分型方法的概念和诊断性能的证明。我们证明了PLP和RCA的高特异性和多重检验测试能力，用于经济的数字量化读数使这项检测更接近临床应用。