这些结果突出了肠道微生物组在介导抗生素对宿主和环境的影响方面的关键作用，这将扩展我们对抗生素污染造成的生态问题的理解。
抗生素污染已成为全世界范围内一个新兴的环境问题。近年来，环境中的残留抗生素受到了极大的关注，因为它们在水生环境中的出现引起了对细菌耐药性的引入和传播的担忧，但抗生素污染所引起的生态问题仍有待阐明，尤其是目前我们对抗生素与不同生态要素之间的相互作用知之甚少。
在本研究中，作者研究了3种代表性抗生素（即：四环素、红霉素和磺胺甲恶唑）的长期影响，重点是由两栖类蝌蚪、肠道和环境细菌和真菌群落以及水参数组成的简化人工淡水系统中上述3种抗生素的长期影响。研究根据结果得出：抗生素暴露降低了蝌蚪的适应性，增加了其死亡率和生理异常，改变了水质，特别是抗生素暴露破坏了氮稳态。对生物体、共生体和系统水平的连续分析表明，抗生素直接通过非靶向效应破坏蝌蚪的代谢(如：四氢生物蝶呤代谢)。抗生素还改变了蝌蚪肠道细菌和真菌的多样性和组成，部分解释了蝌蚪的健康情况发生明显的变化是因抗生素暴露所致。此外，蝌蚪肠道微生物组(即：蓝细菌和担子菌OTUs)的变化部分解释了水分参数的变化。
相反，环境微生物群和宏基因组保持了相对来说比较稳定，环境变化没影响。这些结果突出了肠道微生物组在介导抗生素对宿主和环境的影响方面的关键作用，这将扩展我们对抗生素污染造成的生态问题的理解。
图1所示。实验设计概述。左边是3个不同复杂度的实验系统层次;右边是实验系统和测量的图表。
本实验检测了抗生素暴露对环境参数的影响(图2a)。在低浓度和高浓度的四环素和红霉素降低了水的pH值(双向方差分析结果p0.05)。红霉素导致水的电导率以1000ng/L下降，而磺胺甲恶唑以200ng/L导致相反的结果。除S200处理外，其余处理组的水的总硬度均有所下降。
抗生素暴露降低了环境水中的总氮含量，但氨氮含量没有受一定的影响。E100、E1000、T1000组硝态氮水平高于对照组，E1000组硝态氮水平也高于对照组。这些结果提示抗生素暴露对氮稳态的破坏。
抗生素暴露导致峨嵋林蛙(Rana omeimontis)蝌蚪死亡和发生畸形(图2b-d)。磺胺甲恶唑是3种抗生素中最有害的一种，致死率超过10% ，畸形率超过20%。在T100以外的处理组中，30阶段以前的个体明显多于实验末期的对照组(调整后的p0.05，后置z检验和Bonferroni调整)(图2e)。抗生素对蝌蚪体重的影响不显著(p = 0.269，单因素方差分析，图2f所示)。
然而，暴露确实改变了蝌蚪器官的相对大小(单因素方差分析，图2g-i所示)。四环素和红霉素以剂量依赖的方式增加尾部相对大小(TSI)，在1000ng/L时观察到明显的增加，而磺胺甲恶唑在50ng/L和200ng/L时诱导尾部相对大小明显的增加。此外，磺胺甲恶唑以剂量依赖的方式降低了蝌蚪肝脏相对大小(HSI)。红霉素在两种浓度下均能降低肠道相对重量(肠体细胞指数(GSI))，而磺胺甲恶唑和四环素在较低浓度下仅能引起肠体细胞指数(GSI)的显著降低。
图2 抗生素暴露对蝌蚪及水质的影响。(a)水质：不同的字母表示抗生素对测试参数的显著影响(p0.05，双向方差分析)。处理与取样时间点在阈值处p0.05。(b)蝌蚪的存活曲线。(c)说明蝌蚪尾部畸形的照片。(d)蝌蚪的死亡率和畸形率。不同的字母表示处理间的显著差异(p0.05，单因素方差分析)。(e)发育阶段的分布。不同处理间差异有统计学意义(p0.05，χ2)。(f-i)蝌蚪的生理特征: 全体重(f)、相对尾重(g)、肝指数(h)和相对肠重(i)。不同的字母表示处理间的显著差异(p0.05，单因素方差分析结果)。
抗生素暴露改变了蝌蚪的尾部代谢谱(图3a-b)。其中，除T1000(图3c；p0.05，PERMANOVA 基于 Bray-Curtis距离)外，对照组和处理组蝌蚪的尾部代谢谱存在非常明显差异。对于不一样的抗生素，单因素方差分析显示支持向量机的代谢产物差异显著(p0.05) (图3d-e)。3种抗生素共有7种显著变化的代谢产物，分别为: 卟吩胆碱原、水杨酸乙酯、乙硫氨酸乙酯、6-羟基烟酸、8-异前列腺素F2、15-酮前列腺素F1和亮黄素(图3f-g)。四环素和红霉素处理组大部分显著变化的代谢产物为氨基酸及氨基酸的衍生物(约占40%)。
尽管如此，磺胺甲恶唑还是引起了多不饱和脂肪酸及其相关衍生物的显著变化(图3h)，它们的变化模式表明花生四烯酸衍生物(主要是前列腺素)的上调和FA C18、FA C20:5和FA c22衍生物(即氧化脂肪酸)的下调。功能性富集分析突出了抗生素对氨基酸和氨代谢的影响，以及磺胺甲恶唑对叶酸生物合成途径的影响。详细地说，在磺胺甲噁唑处理的蝌蚪中，叶酸生物合成途径的富集是由于它们积累了塞哌特林、7,8-氢生物蝶呤和生物蝶呤，而这些物质是四氢生物蝶呤生物合成的中间体（图S1所示）。
建立偏最小二乘回归模型来研究了表型/生理观察(MMR、TSI、HSI和肠体细胞指数(GSI))与代谢变化之间的潜在联系(图4a-b)。以VIP1.8和p0.05(单因素方差分析，图4c)的阈值进行代谢产物筛选。在所有的四个观察中，筛选出的代谢产物包括大量的氨基酸、维生素和它们的衍生物。多不饱和脂肪酸及其衍生物在MMR和HSI 模型中被筛选。此外，在MMR或HSI 模型中，叶酸生物合成(四氢生物蝶呤生物合成)通过筛选的代谢物突出显示出来。
这意味着在抗生素存在的情况下，四氢生物蝶呤生物合成的变化与MMR或HSI之间的关系。从肠体细胞指数(GSI)模型中筛选出的代谢物突出显示了多种KEGG途径，包括：组氨酸代谢、氨基酰基转移酶合成、维生素b6代谢、乙醛酸和二羧酸代谢，而TSI模型中未曾发现代谢物显著富集(图4d)。
图3 抗生素暴露对蝌蚪尾代谢组的影响。(a)主成分分析散点图(b)Bray-Curtis组之间的距离。(c)Permanova与Bray-Curtis距离的比较结果。(d) 每种抗生素筛选代谢物的阈值不一样。(e)每种抗生素的偏最小二乘模型摘要。(f)呈现明显变化的共有代谢物(SVMs)的Venn 图(g)热图显示3种抗生素共有的SVMs变化模式。(h) SVMs的分类和比例。(i)热图显示了多不饱和脂肪酸和衍生物的变化模式。(j)富集分析结果(p0.05)。注意，大多数多不饱和脂肪酸和衍生物没有包括在上述分析中，因为它们没有相应的KEGG ID。
图4 蝌蚪健康情况与代谢组学的相关性分析。(a-b) PLS模型总结。(c)相关代谢物的分类及比例。(d)富集分析结果(p0.05)。(e)推断出抗生素对蝌蚪健康影响的代谢途径。箭头的宽度表示影响强度。
蝌蚪肠道中的优势细菌门是：变形杆菌门、厚壁菌门和蓝藻菌(图5d)。高丰度的属包括：消食链球菌科的未培养的群体脱硫菌属，和蓝细菌属(图5a-b)。接触红霉素(100和1000ng/L)和磺胺甲恶唑(50ng/L)可降低肠道细菌群落的丰度(ACE指数，图5 c)。所有6个处理组的细菌系统发育多样性均下降，尽管它们的群落多样性(Shannon指数)相当(图5d-e)。T100以外的抗生素处理重塑了肠道微生物群落结构(p0.05，PERMANOVA，图5 f-h和图5所示)。根据距离表和PCoA散点图，四环素和红霉素在肠道细菌群落中引起类似的变化，这与磺胺甲恶唑引起的变化相反。3种抗生素共有的10种细菌(SVB、VIP1.5和p0.05)中，蓝细菌和立克次目相对丰度最高。在四环素和红霉素处理组中，这些细菌的数量增加，但在磺胺甲恶唑存在下减少(图5j)。对其他丰富的细菌类群(1%)，四环素和红霉素降低了梭菌目、嗜胆菌目和放线的丰度，而四环素增加了分枝杆菌的丰度(图5 k)。根据功能预测，细菌群落结构的变化伴随着微生物致病性的潜在变化(图S2d)、初级代谢以及次生代谢(图S2e)。
值得注意的是，从磺胺甲恶唑处理组获得的微生物群进行了减少的光合作用、类胡萝卜素、萜烯和类固醇的生物合成（图S2e）。红霉素组肠道菌群光合作用、甾体合成和氮代谢增加，四环素组肠道菌群类胡萝卜素合成和氮代谢增加。研究根据结果得出，抗生素处理组的肠道微生物群具有较高的异生物降解能力，但对其他抗生素的合成减少或对其他抗生素的耐药性降低（图S2f）。
图5 抗生素暴露对肠道细菌群落的影响。(a-b)门(a)和属(b)水平细菌群落组成。(c-e)α多样性的变化。不同字母表示各组间的显著差异(p0.05，单因素方差分析)。(f)基于加权 Unifrac距离的群体之间的差异。(g)基于加权 Unifrac距离的PCoA散点图(h)加权 Unifrac距离的Permanova 结果。(i)呈现抗生素共有的明显变化的细菌(SVBs)的Venn 图(j)上述3种抗生素均具有同样的SVBs 变化模式。(k)其他大量(1%) SVBs的变化模式。星号表示处理组与对照组之间的差异有显著性(p0.05，单因素方差分析)。
已鉴定的真菌门包括:担子菌门(平均90%)、子囊菌门和壶菌门(图6a)。两种浓度的四环素(1000ng/L)和红霉素处理降低了肠道真菌群落的丰度(ACE指数)和系统发育多样性，但未影响群落多样性(Shannon指数)(图6b-d)。四环素和红霉素在1000ng/L时改变肠道真菌群落结构(p0.05，PERMANOVA；图6 e-g)。四环素导致担子菌OTU1和OTU2之间的平衡，红霉素导致担子菌OTU3的增加(图6 h)。
图6 抗生素暴露对肠道真菌群落的影响。(a)门水平肠道真菌群落组成。(b-d)α多样性的变化。不同字母表示各组间的显著差异(p0.05，单因素方差分析)。(e)Permanova结果。(f-g)PCoA散点图(h)3种优势担子菌OTUs的变化模式。不同字母表示各组间的显著差异(p0.05，单因素方差分析)。
利用偏最小二乘法(PLS)分析了蝌蚪MMR的微生物组变化(R2= 0.796，Q2= 0.454)。以 VIP1.5和p0.05(单因素方差分析)为指标对细菌进行筛选。这强调了蝌蚪MMR与肠道中：骶骨分枝杆菌、产氧光细菌、放线、红螺菌目、立克次体目和嗜酸杆菌丰度之间的潜在相关性（图S3）。但是未有真菌类群被筛选出。
环境中丰度最高的细菌是以拟杆菌(30%)和变形菌(20%) (图7a)。抗生素暴露不影响环境细菌群落的丰度(ACE指数)和多样性(Shannon指数)(图7b-c和S4)。然而，200ng/L的磺胺甲恶唑确实降低了群落的多样性。在所有处理中，抗生素暴露对细菌群落结构没有显著影响(p0.05，PERMANOVA；图7c和S4)。
图7 环境微生物菌群在抗生素应用中的变化。(a)门水平环境细菌群落的组成。(b)细菌群落α多样性的变化。不同字母表示各组间的显著差异(p0.05，单因素方差分析)。(c)细菌群Permanova距离结果。(d)门水平环境真菌群落组成。(e)真菌群落α多样性的变化。不同字母表示各组间的显著差异(p0.05，单因素方差分析)。(f) 真菌群间Permanova距离结果。
在真菌群落方面，环境中丰度最高的真菌包括：子囊菌、红藻门、担子菌和壶菌门(图7d)。1000ng/L红霉素降低了环境真菌群落丰度(ACE指数)和系统发育多样性，但不影响Shannon指数(p0.05，图7f)。四环素(1000ng/L)和磺胺甲恶唑(200ng/L)引起类似的变化，但意义不大。抗生素对环境真菌群落结构影响不显著(p0.05，PERMANOVA；图7 f和s 4)。
此外，作者比较了各组环境微生物的宏基因组。分类分析表明，细菌占总基因的75% 以上，真菌是第二丰富的类群，占总基因的1.3% (图8a)。环境宏基因组中变形菌(30%)、拟杆菌(10%)和氯化亚铁(5%)所占比例最大(图8b)。抗生素处理对细菌毒力因子(图8c)、p450酶(图8d)、碳水化合物活性酶(图8e)和宏基因组中抗生素耐药基因的丰度影响不大(图8f)。
在功能表型方面，磺胺甲恶唑在200ng/L时，造成环境中形成细菌的生物膜显著增加，而别的方面(如呼吸类型和致病性)则不受影响(图8g)。
图8 环境宏基因组分析。(a-b)界(a)和门(b)水平的Unigene分类群分配。(c-d)毒力因子(c)、P450(d)、碳水化合物活性酶(e)和抗生素抗性相关基因(f)的变化。CBM，对碳水化合物的粘附；CE，碳水化合物酯的水解；GH，糖苷键的水解和/或重排；GT，糖苷键的形成；PL，糖苷键的非水解裂解。(g)环境细菌群落的功能表型（由BugBase预测）。不同字母表示组间差异显著（p0.05，单向方差分析）。
作者还建立了结构方程模型(SEMs)，探讨了水质参数变化和蝌蚪健康情况变化的机理。所用的分段扫描电镜模型的参数详见表1。在完整的模型中，环境真菌群落与肠道细菌和真菌群落之间的相关性得到了支持(p0.05)。环境细菌、环境真菌、肠道细菌和肠道真菌的其他途径均无效(p0.05)。在简化模型中，肠道细菌和真菌群落，而不是环境微生物群落，对水分参数的预测是有支持的(p0.05)。相应地，肠道蓝细菌数量与水中硝酸氮、pH值、电导率和容器总硬度(处理重复)之间有显著的相关性。担子菌OTUs与水中亚硝态氮含量、总氮、pH和电导率也有很强的相关性(图9e-f和S6)。
肠道细菌群落和真菌群落都能够预测蝌蚪的MMR，而肠道细菌群落还能够预测蝌蚪的肠体细胞指数(GSI)。宿主代谢组是MMR、HSI、TSI和肠体细胞指数(GSI)的预测因子，但其本身不能被共生微生物群落预测。
图9 生态要素之间的关联分析。(a)建立结构方程模型(SEM)，探讨水质参数和蝌蚪健康状况变化的机制。抗生素处理没有纳入到上述模型。蓝色箭头表示抗生素的自然靶标，尽管这些化合物实际上可能针对其他生物。蓝色箭头表示抗生素的天然靶标，尽管这些化合物实际上可能针对其他生物。对于红色的路径，虚线和实线分别表示由模型支持的不显著和显著的路径。线宽表示系数的十倍绝对值。简化模型的R2值和通径系数显示在图中。(b-f)水中无机氮水平与肠道微生物丰度的相关性。每个点表示每个复制/容器的数据对。对于每个数据对，微生物丰度是两个肠道样本的平均值。(g)环境因素与肠道微生物相关性的网络研究。红边和蓝边分别表示正相关和负相关。
我们的研究结果表明，3种抗生素(四环素、红霉素和磺胺甲恶唑)对水生态系统的各种元素有不同的影响。简而言之，即使磺胺甲恶唑的浓度比其他两种抗生素低得多，它对蝌蚪的不良影响更为严重。磺胺甲恶唑对肠道共生菌的影响与四环素和红霉素对肠道共生菌的影响相反。这可能是由于磺胺甲恶唑(抑制叶酸合成)和四环素/红霉素(抑制蛋白质合成)作用机制不同所致。磺胺甲恶唑对肠道共生菌几乎没有影响，而四环素和红霉素对肠道共生菌有影响。这可能是由于本研究中四环素和红霉素处理浓度较高所致。在接下来的章节中，我们将讨论潜在的机制所造成的毒性后果的抗生素，重点是不同的元素之间的变化关系系统。
这项研究的结果表明，抗生素暴露会对两栖动物幼虫具致死的影响，而磺胺甲恶唑对蝌蚪的毒性尤其大。即使这些蝌蚪可以完全变态，它们在陆地生活的后续阶段的生存仍然会受到影响，因为在变态高潮时的生理状态，例如身体大小和能量储存，对于幼蛙未来的表现是至关重要的。虽然各组蝌蚪的整体重量没有差异，但是由于TSI的增加，处理过的蝌蚪的鼻孔-通气孔体积趋于变小。此外，磺胺甲恶唑导致了蝌蚪肝脏指数的下降，这意味着这些蝌蚪的脂肪储存量减少了。对于峨眉林蛙和许多其他物种的蝌蚪来说，肝脏脂肪是它们主要的脂肪储存，以支持变质高潮阶段之后的非摄食期。结合致死和亚致死的结果，可以推断当前环境水平的抗生素污染可能已经威胁到两栖动物种群的生存。
新陈代谢的变化表明了生物体对环境变化作出反应的方式。抗生素暴露会引起代谢产物的系统性变化，包括氨基酸、脂肪酸、核苷酸、维生素和许多其他物质的代谢(图3h)。然而，肠道微生物群落的变化很难预测这些代谢变化(图9a-d)。这意味着抗生素可以直接影响蝌蚪的新陈代谢，这也得到了本研究代谢数据的支持。抗生素，包括四环素和红霉素，可能在宿主体内引起“非靶向”效应，而最著名的“非靶向”效应是磺胺甲恶唑通过抑制海蝶呤还原酶来干扰四氢生物蝶呤的生物合成。在这项研究中也发现了类似的现象(图3j和S1)。
这表明四氢生物蝶呤生物合成是磺胺甲恶唑在动物体内的一个共同目标。鉴于四氢生物蝶呤生物合成的变化与蝌蚪体内的MMR或HSI密切相关，有人推测磺胺甲恶唑可能通过扰乱四氢生物蝶呤的生物合成而影响蝌蚪的生存和肝脏生理。其基本原理是，以前的研究已经证明四氢基喋呤缺乏症可以导致小鼠运动功能障碍，肌肉张力受损，身体脂肪水平和分布异常，而且它对于胚胎发育是致命的。此外，磺胺甲恶唑和其他抗生素可能会影响蝌蚪体内的多不饱和脂肪酸代谢。磺胺甲恶唑已经被证明是一种在果蝇体内的脂质代谢干扰物。
以往的研究表明，峨眉林蛙蝌蚪的尾部是合成多不饱和脂肪酸和活性FFA衍生物的重要器官。这些活性FFA衍生物在维持身体内环境稳定方面发挥关键作用，包括调节脂肪积累，它们的破坏与许多疾病和身体功能障碍有关。因此，多不饱和脂肪酸代谢紊乱可能是磺胺甲噁唑致死和肝脏异常的重要机制。
本研究的结果也暗示了暴露于抗生素的蝌蚪中代谢体变化和增加TSI之间的潜在联系(图4c)。然而，没有突出的KEGG通路或功能代谢组(如：多不饱和脂肪酸)被强调。上述这个推论是合理的，因为尾巴相对大小的增加不太可能是一个直接的有害结果，而是一个应对压力的折中方案。支撑这种形态可塑性的代谢变化可能不那么强烈。红霉素降低了蝌蚪的肠体细胞指数(GSI)，并引起了最显著的氨基酸代谢变化(图3h)。这种抗生素可以作为胃动素受体激动剂，刺激宿主的胃肠运动，并促进消化不良。这种效应可以解释肠体细胞指数(GSI)的观察结果，因为肠道重量主要取决于蝌蚪体内肠体细胞指数(GSI)的含量。氨基酸池的变化在抗生素暴露的动物中很常见。这些化合物的变化性可能来自于它们的结构和功能的多样性。
在本研究中，偏最小二乘回归分析的结果表明蝌蚪体内氨基酸代谢的变化与肠体细胞指数(GSI)之间存在潜在的联系，但是还需要进一步的研究来确定是否存在一个因果关系。总的来说，结果表明抗生素可能直接针对蝌蚪的新陈代谢，从而降低它们的适应性(图10)。
图10 一个推导出来的图来解释抗生素污染如何影响水系统。实线和虚线分别表示主线 肠道微生物群在介导抗生素对宿主健康的影响中的作用
本研究中提到的3种抗生素减少了肠道细菌和真菌群落的α 多样性。由于肠道菌群不是真菌群落变化的支持性预测因子，推测抗生素可能直接影响真菌群落。最有趣的发现之一是，抗生素不影响Shannon指数，但确实降低了PD整树的指数，这表明抗生素抗药性菌株的多样性。与此相一致的是，肠道微生物群表现出增加的异生物降解能力，降低了对其他抗生素的抗性，并减少了一些其他抗生素的合成(图S2f)。
抗生素暴露对肠道细菌的选择压力，这可能推动了共生微生物群的抗生素耐药性的转变和改善。
从长远来看，这种变化对生态系统是有害的。在细菌群落中，蓝细菌和立克次目是由抗生素暴露引起的主要变化。由螺旋藻（蓝藻）加工而成的饮食很可能是蓝藻和立克次体的重要来源。事实上，之前的研究已经表明，蓝细菌和立克次目是磷虾粉、鱼粉、鱿鱼粉、小麦面筋、马铃薯淀粉、鱼油、螺旋藻、虾青素和大蒜油的混合物中的主要细菌。然而，在肠道微生物群中检测到这两种细菌并不能归因于肠道中的食物残渣，因为它们的丰富程度在不同的群体中表现出显著的差异。此外，这两种细菌在动物肠粘膜中的定殖已被广泛报道。蓝细菌是环境抗生素抗药性基因的储存库和来源，包括那些促进四环素、红霉素和磺胺类耐药性的基因。这在这项研究中得到了部分证明，蓝藻菌株对四环素和红霉素具有耐药性，但对磺胺甲恶唑敏感。
肠道真菌群落对四环素和红霉素敏感，而对磺胺甲恶唑无论是低浓度还是高浓度均呈耐药性。
肠道菌群是蝌蚪MMR的预测指标(图9a)。本研究的实验数据表明，蓝细菌和立克次目的丰度与各处理组的蝌蚪健康呈负相关。
然而，蓝藻和立克次体水平升高或降低的蝌蚪显示出比对照组中的个体更高的MMR。可以推断，这两种细菌的变化可能解释了最多一种情况下MMR的增加。考虑到蓝细菌的产毒特性和立克次体的致病性，认为蓝细菌和立克次体丰度的增加更有可能对蝌蚪产生危害。分枝杆菌的丰度与蝌蚪MMR也有很强的正相关性。分枝杆菌对多种抗生素具有天然抗性。这一结论得到了实验数据的支持，磺胺甲恶唑在蝌蚪肠道中的含量也得到了进一步的提高。分枝杆菌已被公认为是一种流行的两栖类病原体，而且分枝杆菌感染是出了名的难以治疗。它的增加可能是磺胺甲噁唑处理组高MMR的潜在因素。由于肠道微生物群落对动物生理功能，特别是营养和代谢有着深远的影响，因此肠道细菌群落也可以作为宿主肠体细胞指数(GSI)的预测指标(图9 d)。虽然宿主代谢和肠道细菌群落都是肠体细胞指数(GSI) 宿主的预测因子，但它的总的解释率仍然很低(0.35)。最合理的解释之一是，抗生素不仅重塑了细菌群落结构，而且影响了肠道微生物群的基因表达和代谢活动，这在本研究中没有考虑到。
总的来说，抗生素污染重新塑造了蝌蚪的肠道细菌群落，增加了有害菌株的相对数量，这可能会损害寄主的健康
抗生素暴露改变了水的pH值、电导率、总硬度和氮稳态。各组间水中亚硝酸盐含量与氨氮含量呈负相关(图9f)，在红霉素存在下这两个指标呈相反的变化趋势(图2a)。结合硝态氮在四环素和红霉素存在下的增加，表明抗生素可干扰水体生态系统的硝化或反硝化过程。氮含量的变化被认为与包括水体富营养化在内的多种环境问题有关。应该指出的是，由于水生植物和土壤的存在，抗生素引起的环境参数变化在田间可能不那么突出。然而，这并不意味着抗生素的影响将不那么严重，而是在实地掩盖了。
蝌蚪肠道微生物群比环境微生物群能更好地预测水质的变化。具体而言，检测到硝态氮水平与肠道蓝藻的丰度之间存在很强的相关性(图9b)。蓝藻在它们利用的氮源中表现出极大的灵活性。蓝藻门的许多物种能够通过合成氨、亚硝酸盐或硝酸盐来固定氮气，当低水无机氮水平较低时，这些物种可以用来支持它们自己或它们共生体的生长。因此，四环素和红霉素处理组肠道蓝细菌的高丰度可能是水体硝态氮水平升高的潜在原因。亚硝态氮水平与肠道担子菌OTU2呈正相关，与担子菌OTU1呈负相关。水氨氮水平与担子菌OTU1呈正相关，与担子菌OTU3呈负相关。
肠道真菌群落的变化可能是导致抗生素处理水系统中氨和亚硝酸盐平衡失调的部分原因。
由于氮代谢的变化，环境pH值、电导率和总硬度也可能受到影响，因为氮代谢与这些参数之间存在非常明显的相关性(图9f)。我们的模型对水质变化的解释率仅为49%。这在某种程度上预示着还有其他因素促成了环境参数的变化。其中两个候选因素是动物排泄的粪便量和药物的降解。进一步的研究应该考虑这些变量，以建立更健全的模型。值得一提的是，我国水系动物密度相对较高。尽管这样的设计使得生态元素之间的联系更容易被发现，但它可能夸大了抗生素污染在真实环境中造成的后果，特别是一些可能由动物及其共生生物介导的后果。
相对高浓度的抗生素暴露确实降低了环境微生物群落的α 多样性，但并没改变群落结构，也没有促进抗生素抗药性基因的繁荣。唯一有必要注意一下的功能变化是形成细菌的生物膜的比例增加，这是增强抗生素抗药性的另一种策略。环境微生物群落的稳定性可能归因于土壤中高的α多样性 (图5a-c和图7a-c)和先天性高丰度的抗生素耐药基因。然而，研究结果并没有否定环境微生物群对抗生素污染的反应，特别是当水体中含有大量蓝藻时，由于环境的复杂性和微生物组成在自然条件和实验条件之间是有区别的。另外，环境样品的复制数量小于肠道样品的复制数量。这可能会影响识别不同群体之间差异的能力，需要更大样本量的进一步研究来确认环境土壤微生物群对抗生素污染的反应性。
研究结果揭示了抗生素在现有环境条件下对人工水系统的不良影响，并通过动物、共生微生物群、环境微生物群和环境因子之间的相互作用揭示了抗生素的潜在作用机制。这些结果提示抗生素可能直接作用于宿主代谢组和真菌群落，突出了抗生素对水生生物靶外效应的威胁。