科研 浙大(IF:16.8)：多组学研究揭示与奶牛饲料效率有关的瘤胃微生物新特征(国人佳作)
本研究的结果可能有助于未来的研究，以培育或选择高饲料效率奶牛，并从瘤胃中获取碳水化合物降解酶作为饲料添加剂或生物催化剂，来利用木质纤维素生物质中的生物能。
随着全球人口的持续增长，人类和牲畜之间对资源的竞争在不断加剧。增加乳蛋白产量和提高饲料效率对于人类满足对优质乳蛋白的需求慢慢的变重要。在之前的一项研究中，我们得知奶牛的乳蛋白产量与瘤胃微生物组有关。本研究的目的是利用宏基因组学、宏转录组学和代谢组学来阐明奶牛饲料效率的潜在微生物特征。
通过比较宏基因组和宏转录组数据，发现宏转录组是揭示瘤胃微生物功能与寄主生产性能之间关系的更好的途径。
通过对瘤胃微生物组共现网络分析，发现不同饲料效率的动物之间有不同的微生物相互作用模式，高饲料效率的动物比低饲料效率的动物具有更多和更强的关联。
在高饲料效率动物瘤胃中，Selenomonas与属于Succinivibrionaceae科的成员之间有着正相关作用，它们是重要的生态功能和活跃的碳水化合物代谢功能的关键成员。
在代谢水平上，使用随机森林机器学习进行的分析表明，6种瘤胃代谢物（均来自碳水化合物）可用作代谢标记物，可以区分高效和低效微生物群落，预测准确率为95.06%。
本研究结果为了解与奶牛饲料效率相关的新瘤胃微生物特征提供了新的见解，这为将来乳品行业选择效率更加高的动物提供了基础。这些基本知识还将为今后提高奶牛饲料效率的干预措施提供帮助。
本研究通过整合宏基因组学、宏转录组学和代谢组学测序数据，揭示了与奶牛饲料效率有关的瘤胃微生物新特征。选取泌乳中期荷斯坦奶牛60头进行采食量测定，同时通过口腔胃管在早餐前采集瘤胃内容物样品用于后续分析。通过干物质摄入量（DMI）和牛奶产量数据计算了60头奶牛的饲料转化率（FCR），并选择18头奶牛分为高饲料效率奶牛（HiEf）组和低饲料效率奶牛（LoEf）组。
对HiEf组和LoEf组奶牛瘤胃内容物样品进行宏基因组学、宏转录组学、代谢组学分析，鉴定两组奶牛瘤胃微生物组成、瘤胃微生物功能鉴定、瘤胃微生物相互作用模式以及微生物-代谢产物相互作用与寄主饲料效率的关系。
高饲料效率（HiEf）奶牛和低饲料效率（LoEf）奶牛的干物质摄入量（DMI）相似（P = 0.444），但HiEf奶牛的产奶量、饲料转化效率（FCR）和牛奶N效率均高于LoEf奶牛（图2A和表S1）。与LoEf奶牛相比，HiEf奶牛的能量校正乳（ECM）：DMI比率也更高（P = 0.002）（表S1）。
两组奶牛在牛奶尿素氮或任何确定的瘤胃发酵特征方面没有差异。两组奶牛的牛奶尿素氮或任何已测定的瘤胃发酵特性方面没有差异。
从宏基因组测序中总共获得了138.52Gb的数据，每个样本的数据量为7.70 ± 0.46 Gb（表S2）。在质控过滤和去除宿主DNA序列后，共保留了137.16 Gb的数据。
从细菌宏基因组序列（26,591,712 ± 1,926,636个序列）中，共鉴定出62个门，1339属，5362个细菌物种，其中属于12个门，24个属的20个细菌物种是优势菌群（在每个样品中相对丰度 0.5%，流行率 20%，表S3）。
优势菌门在两组奶牛之间的相对丰度没有差异（图2B）。在属水平上，LoEf奶牛中未分类的厚壁菌属比HiEf奶牛更丰富（P 0.05），而Selenomonas则出现相反的趋势（图2C）。在物种水平上，三种不能培养的厚壁菌门物种的相对丰富度在LoEf奶牛中高于HiEf奶牛（P 0.05），但Selenomonas bovis则出现相反的趋势（图2D）。古菌宏基因组序列（每个样本391,764 ± 145,445个）可以被分类为6个门、49 个属和117个古菌物种，其中属于1个门、6个属的13个古菌物种是优势菌群（表S3）。在门水平上，HiEf奶牛瘤胃中只有一个低丰度古菌门（Bathyarchaeota）比LoEf奶牛更丰富（P 0.05）（表S3）。Methanobrevibacter是丰富度最高的古菌属，而其在HiEf奶牛中的丰富度低于LoEf奶牛（表S3）。两组奶牛的瘤胃古菌在物种水平上的相对丰度没有差异（表S3）。
每个样本平均生成582,310 ± 526,904个真菌宏基因组序列。这些线个线个真菌物种是优势菌群（表S3）。两组奶牛之间检测到的真菌分类群的对丰度没有差异（表S3）。
根据宏转录组测序数据，每个样本分别平均生成了17,291,314± 823,431、182,657 ± 105,195 和 361,030 ± 221,841条细菌、古菌和真菌序列。基于宏转录组数据的微生物组Alpha多样性指数表明，只有古菌Shannon多样性指数在HiEf奶牛中高于LoEf奶牛（P 0.05，图S2）。优势细菌门在两组间无显著差异（P 0.05）（补充表 S4）。
在物种水平上，5个物种的相对丰度在2组奶牛之间有差异，其中， Selenomonas bovis在HiEf奶牛中的丰度高于LoEf奶牛，4个未鉴定的物种在LoEf奶牛中的丰度高于HiEf奶牛，其中包括2个厚壁菌门的物种和1个Prevotella和Lachnospiraceae分类单元（校正后P 0.05，表S4）。
在鉴定出的古菌分类群中，只有Methanobrevibacter在两组奶牛间相对丰富度存在一定的差异（LoEf奶牛组相对丰富度更高，调整后P 0.05）。两组间的线. 不同饲料效率奶牛宏基因组学鉴定的表型数据和瘤胃细菌分类群的比较。
宏基因组测序数据共鉴定出了249个KEGG第3级代谢途径。在排除外源性途径和低丰度和流行率（CPM 5和流行率20%）代谢途径后，剩下218条KEGG第3级代谢途径（表S5）。这些微生物代谢途径可以分为4个第1级代谢途径，包括“代谢”（71.04%）、“遗传信息处理”（15.39%）、“环境信息处理”（6.87%）和“细胞过程”（6.70%）。
两组奶牛间最丰富的20个代谢途径不存在显著差异（P 0.05）（图S3）。我们进一步选择了涉及氨基酸代谢、糖代谢、能量代谢、辅助因子和维生素代谢的关键代谢途径进行分析。结果发现，只有一个代谢途径“视黄醇代谢”在两组奶牛之间存在一定的差异（在HiEf奶牛的瘤胃中含量较低，P 0.05）（图 3A）。基于宏基因组测序数据的微生物功能NMDS显示两组奶牛之间存在两个聚类（stress = 0.063，ANOSIM R = 0.367，P 0.05，图S1C）。
奶牛瘤胃宏转录组数据中，共鉴定出了358个KEGG第3级代谢途径。在排除外源性途径和低丰度和流行率（CPM 5和流行率20%）代谢途径后，剩下193条KEGG第3级代谢途径（表S6）。这些微生物代谢途径分为4个第1级代谢途径，包括“代谢”（49.22%）、“遗传信息处理”（29.86%）、“环境信息处理”（13.07%）和“细胞过程”（7.84%）。
两组奶牛之间已鉴定的KEG功能的Shannon和Simpson多样性指数均无显著差异（图S2C和S2D）。在最丰富的20个代谢途径中，与LoEf奶牛相比，10种代谢途径在HiEf奶牛中显著富集（P 0.05）（图S4A）。
通过比较两个奶牛组之间所有已识别代谢途径的丰富度，发现193条代谢途径有34条存在差异（P 0.05），且HiEf奶牛中所有差异代谢途径均比LoEf奶牛更丰富（图S4B）。
这些途径包括碳代谢、糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、碳固定、嘌呤代谢、丁酸代谢、氧化磷酸化、淀粉和蔗糖代谢、群体感应、果糖和甘露糖代谢。我们进一步选择了涉及氨基酸代谢、碳水化合物代谢、能量代谢以及辅因子和维生素代谢的关键途径进行分析。
发现HiEf 奶牛的4种氨基酸代谢途径、11种碳水化合物代谢途径、2种能量代谢途径和2种维生素代谢途径比LoEf奶牛更丰富（P 0.05）（图3B）。使用宏转录组学检测到的途径反映了活跃的代谢途径，与使用宏基因组学鉴定的潜在功能相比，更接近反映取样时的实际功能和寄主饲料效率。
因此，我们只进一步关注活跃的代谢功能。在转录组中检测到的涉及挥发性脂肪酸（VFA）和甲烷代谢的关键酶见图S5。7种酶在HiEf奶牛体内显著富集（P 0.05），其中4种酶参与琥珀酸途径，1种酶参与丙酸生成的丙烯酸酯途径，2种酶参与乙酸和丁酸的生成。
参与甲烷生成途径的3种酶在LoEf奶牛的微生物群中显著富集（P 0.05）（图S5）。
图3. 在高饲料效率和低饲料效率奶牛的宏基因组和宏转录组中确定的代谢途径的变化倍数。
共现网络分析共显示了228个共现关系，不同饲料效率的奶牛显示出不同的共现模式。在HiEf奶牛瘤胃微生物组中，共发现186个连接，其中属于厚壁菌门的分类群之间的正相关关系最多，而属于厚壁菌门的分类群与属于拟杆菌门的分类群之间存在最多的负相关关系（图4A）。
而值得注意的是，在HiEf动物中显著富集的Selenomonas与Succinivibrio，Succinimonas和Ruminobacter呈显著正相关关系。而这三个分类群同样与Aeromonas和Succinatimonas呈正相关关系。在LoEf奶牛瘤胃微生物组中，可以观察到99种相关性关系，属于厚壁菌门的分类群相互之间正相关，而与Prevotella呈负相关关系（图4A）。
共现网络同时还揭示了一些瘤胃微生物分类群与饲料效率相关功能之间的关系（图4B）。共发现16个正相关和24个负相关关系（P 0.05）。
瘤胃代谢组鉴定出284种代谢产物（表S7）。将这些代谢物与FCR表型进行Spearman相关性分析，以筛选与饲料效率相关的代谢物。基于Spearman相关性分析（P 0.05），共有31种瘤胃代谢物被认为与饲料效率相关代谢物，并使用随机森林模型预测饲料效率。
通过随机森林模型选择6种与饲料效率相关的代谢产物，包括乳酸、5-氨基戊酸、2,4-二氨基丁酸、月桂酸、4-羟基丁酸和2-羟基戊酸（MDA 4，图5A）。即受试者工作特征曲线（ROC）加上插入的混淆矩阵表示0.9506的AUC。在我们的试验中，9只HiEf奶牛中有8只预测成功，9只LoEf动物中有6只预测成功。模型的交叉验证（99倍）获得的Kappa系数为0.71，模型误差方差为0.001。为了揭示代谢组学中基因及其产物之间的关系，我们进行了微生物和代谢组联合分析（microbe-metabolite vectors，mmvec）。图5B和C分别表示了HiEf奶牛和LoEf奶牛微生物与代谢产物相互作用的多组学双标图。
根据代谢物与饲料效率的相关系数进行着色，无论是高效率奶牛（图5B）还是低效率奶牛（图5C）中，代谢物都没有产生分离。
特定代谢物的推断条件概率的热图表示了高效率奶牛和低效率奶牛中微生物和代谢物之间不同的相互作用模式。
奶牛等动物的动物生产性能，包括饲料效率、甲烷排放和泌乳性状，在很大程度上取决于或受瘤胃微生物组的影响。
迄今为止，大多数前人的研究都是通过DNA分析技术来研究瘤胃微生物与宿主生产性能参数的关系。然而，包括宏基因组学在内的基于DNA的分析，既能检测活的微生物，也能检测死的微生物，并且所有的基因都不考虑表达情况。基于RNA的分析，包括宏转录组学，可以克服上述问题，尽管仍存在一些局限性，例如仅在样本采集时检测基因表达，不能解决生物学上的挑战：RNA的浓度可能不一定与生长持续相关。
事实上，最近的研究报道，使用宏基因组学和宏转录组学可能会得到不同的结果。一项关于牛肉研究得出结论，与宏基因组学揭示的潜在功能相比，宏转录组学揭示的转录活性功能更好地反映了微生物群落的实际活性功能。
在我们的研究中，宏转录组学分析发现，在高或低饲料效率的奶牛中，前20个活性代谢途径中有一半的丰富度存在差异，而在宏基因组学中却没有发现任何差异。
我们对奶牛的研究以及之前对牛肉和绵羊的研究表明，宏转录组学更适合于揭示瘤胃微生物功能与宿主动物生产性能之间的关系。
为了最大限度地揭示这种关联，我们还使用了代谢组学。三种组学整合分析可以帮助我们解决：瘤胃微生物如何发挥作用，及其相互作用对奶牛饲料效率的影响？ 通过对两组奶牛瘤胃微生物组成的比较，发现细菌和古细菌与寄主饲料效率有显著的相关性，，而真菌与宿主饲料效率无显著相关性
。大多数已发表的研究集中在瘤胃原核生物，强调细菌和古细菌在影响饲料效率的重要性。瘤胃真菌在饲料消化过程中发挥着重要作用，但对其与饲料效率的关系研究较少。
有研究者利用宏转录组学对肉牛瘤胃真核生物群落进行了表征，发现不同饲料效率的动物瘤胃原生动物和真菌存在非常明显差异。在我们的研究中，两组奶牛的真菌群落没有显著差异，这与前人对肉牛的研究结果存在一定的出入，与之前对奶牛的宏基因组研究结果一致。
这种差异可能是由于不同研究中使用的动物物种（肉牛和奶牛）和方法（基于 DNA 或 RNA ）的不同造成的。至于古生菌，在 LoEf 奶牛中， Methanobrevibacter 是奶牛瘤胃中丰富度最高的产甲烷菌，这与之前对肉牛和奶牛的研究结果一致。更有趣的是，在 LoEf 奶牛的宏转录组结果中产甲烷途径也上调。
这些结果表明 LoEf 奶牛比 HiEf 奶牛消耗了更多的膳食能量。饲养饲料效率奶牛也可能降低奶牛甲烷排放量。 由于细菌在饲料消化和发酵过程中发挥着重要的作用，以及对可溶性单体（糖和氨基酸）和二次发酵产物（乳酸、琥珀酸和H2）的利用，因此，细菌的活性代谢功能和相互作用可能决定或影响寄主的饲料效率。
在本研究中，共现网络揭示了不同饲料效率的两组奶牛之间细菌群落的共生模式，这表明了潜在的相互作用。与LoEf奶牛相比，HiEf奶牛体内的连接数量更多（186对99），表明前者的微生物组中微生物之间的相互作用比后者更多。HiEf奶牛的瘤胃细菌网络的中心枢纽包括几种普遍存在的细菌属（Prevotella，Ruminiclostridium和Oscillibacter）（MCC score 100）。
表明这些细菌可能在HiEf奶牛瘤胃微生物组的相互作用中发挥了潜在的作用。
有研究表明，这些属的成员可以利用糖和其他微生物的一些发酵产物生产琥珀酸盐，乳酸盐，乙酸盐和甲酸盐。大多数属于Selenomonas的菌株可以利用淀粉产生乳酸盐、乙酸盐和丙酸盐。Succinivibrionaceae的成员主要利用氢气，生产琥珀酸盐（丙酸盐的前体），将氢气从甲烷产生中分离出来。
事实上，这个分类群被证实与牛的高饲料效率有关。综合本研究和以往的研究结果，Selenomonas和Succinivibrionaceae科的成员之间可能存在正相互作用，并且由于它们的生态功能，它们在HiEf动物瘤胃中作为功能关键细菌发挥了重要作用。这些关键物种的丰富度与其活跃的代谢功能之间的正相关进一步支持了它们在HiEf动物有效利用饲料中的潜在作用。
在此前的一项研究中，我们发现瘤胃代谢产物与奶牛泌乳性能（乳蛋白产量）的关系比微生物组成或功能更密切。因此，在本研究中，我们也利用代谢组学来探究瘤胃微生物代谢产物与饲料效率之间的关系。
我们发现6种代谢物（主要是碳水化合物代谢）可以有效地预测宿主的饲料效率，准确率为95.06%。
此外，我们在具有不同饲料效率奶牛的瘤胃微生物组中发现了不同的微生物-代谢物相互作用模式，有趣的是，这6个标记物是高饲料效率和低饲料效率奶牛微生物-代谢产物互作的重要贡献者，并且在区分不同饲料效率奶牛之间的微生物-代谢物相互作用模式中发挥了关键作用。
机器学习方法的发展促进了微生物群预测宿主表型的应用，包括预测疾病风险和不同动物物种的表型。
然而，就我们所知，关于瘤胃微生物代谢物预测寄主生产性能的研究还十分有限，尤其是在反刍动物中。值得注意的是，由于用于鉴定微生物或代谢标记物的表征方法不同，在实践中使用组学数据预测表型仍然具有挑战性。
因此，还需要使用标准化的组学鉴定流程来测试这些标记物的稳定性，这能够在一定程度上帮助我们在不久的将来把我们的发现应用到实践中。
使用多组学的研究仍然十分昂贵，因此，最近在反刍动物上使用多组学的几项研究样本量都不大（3-10）。
本研究的样本量（每头牛9个）比同类研究报道的样本量大，但仍然相对较小。如本文“方法”中所述，我们的样本量就动物表型数据提供了足够的可信力（statistical power：99.67%，effect size：0.78）。
宏基因组和宏转录组数据的组间差异分析（Analysis of similarities，ANOSIM）表明，两组奶牛之间的差异显著大于每组中奶牛个体之间的差异。
然而，在未来的多组学研究中应该考虑更大的样本量，以便更好的研究微生物对寄主生长的影响机制。
综上，我们整合了宏基因组学、宏转录组学和代谢组学，发现了瘤胃微生物组的一些新特征，这些特征可能与奶牛的饲料效率相关（图6）。对这些瘤胃微生物分类、功能和代谢特征的新认识可以提高选择动物的能力，从而在乳制品生产中取得更好的表现。
图6. 工作模型来解释微生物分类群、活性碳水化合物代谢和代谢产物可能与奶牛饲料效率的相关性。
与宏基因组学相比，宏转录组学是揭示奶牛瘤胃微生物功能与饲料效率之间关系的更好方法。
共现分析结果表明，不同饲料效率的奶牛瘤胃微生物群落可能存在不同的相互作用模式，高效饲料奶牛瘤胃微生物群落具有较强的相关性。值得注意的是，在HiEf奶牛瘤胃中，Selenomonas与属于Succinivibrionaceae科的某些物种之间可能存在正相互作用，并作为关键菌发挥及其重要的作用。通过随机森林模型鉴定出的6种代谢物（全部来自碳水化合物代谢）可能作为代谢标记物，用于区分高饲料效率和低饲料效率的瘤胃微生物组或奶牛。
本研究的结果可能有助于未来的研究，以培育或选择高饲料效率奶牛，并从瘤胃中获取碳水化合物降解酶作为饲料添加剂或生物催化剂，来利用木质纤维素生物质中的生物能。