本研究利用16S核糖体RNA(rRNA)基因测序比较了CUMS食蟹猴和健康对照的大肠粘膜和肠腔微生物组的生物地理学，并计算了区别扩增子序列变异(ASVs)与抑郁样行为之间的关系。然后，基于ASVs的相对丰度，通过共现分析构建了这些动物的关键共变网络。
以往对重度抑郁症(MDD)病理生理学的研究大多集中在粪便样本上，这限制了对抑郁症患者肠道粘膜和肠腔微生物群的鉴定。在本研究中，我们解决了这一知识鸿沟。雄性食蟹猴(Macaca fascicularis)被随机分为慢性不可预测轻度应激 (CUMS) 组或无应激对照组，两组均完成行为测试。造模结束后，16S核糖体RNA 基因测序分析盲肠、升结肠、横结肠和降结肠成对粘膜和肠腔样本的微生物组成。通过靶向代谢组学分析了肠腔样品中参与碳水化合物或能量代谢的34种代谢物水平。与对照组相比，CUMS食蟹猴表现出明显的抑郁样行为。我们得知两组之间的粘膜和肠腔微生物组成存在一定的差异，其特征是门水平的厚壁菌门和拟杆菌门，以及科水平的Prevotellaceae和Lachnospiraceae。大多数差异微生物与抑郁样行为相关。此外，我们得知两组粘膜有27个显著差异的微生物群落，在管腔中有一种，主要参与碳水化合物和能量代谢。其中有9种代谢物在CUMS食蟹猴中被耗尽。
综上所述，具有抑郁样行为的CUMS食蟹猴与粘膜和肠腔内共变菌群、碳水化合物和能量代谢的显著改变相关。进一步的研究应集中在粘膜和腔内微生物群以提供MDD发病机制中微生物改变的更深入的时空视角。
重度抑郁症(MDD)目前影响全球超过3亿人，是造成精神相关疾病负担的根本原因。目前，有许多神经生物学紊乱可能合理地解释了MDD的症状，例如单胺类神经递质的缺失，免疫系统的改变、内分泌紊乱以及神经营养因子改变。这些具体的发病机制仍然不清楚。最近的研究根据结果得出，肠道微生物组异常已成为抑郁症病理生理学的关键组成部分。我们最近报道了MDD与肠道微生物组的改变有关，将MDD粪便微生物群移植到无菌小鼠或微生物群耗竭的大鼠会导致抑郁样行为。以前的大多数临床研究都集中在粪便微生物组上，而没有专对于肠道粘膜和肠腔微生物组。粪便微生物组不同于肠道粘膜和肠腔部位的微生物群落，并且这种差异在结肠的不同长度部位也存在空间变化。因此，了解MDD中肠道粘膜和腔内微生物特征之间的关系和差异对于了解肠道微生物组在MDD发病机制中的作用至关重要。
在MDD患者中，收集整个肠道的粘膜和管腔样本是不可行的。啮齿动物模型通常用于抑郁症，并且小鼠的粘膜和管腔内容物很容易获得；然而，无论是其结肠内容物颗粒状、稀疏的性质，还是其原生微生物组成都不能完全代表人类肠道。最近的一项研究指出，人类和小鼠之间只有5.59%的已鉴定微生物基因重叠；相比之下，食蟹猴已鉴定细菌基因中39.49%在人类样本中发现。更重要的是，由于与人类在神经发育、社会行为、情绪调节和压力反应方面的相似性增加，非人类灵长类动物(NHP)提供了更优的精神疾病机制见解。此前，与Shivery等人的研究结果一致，我们开发了用于评估、定义和分类圈养食蟹猴(Macaca fascicularis)的抑郁样行为和其他行为的一套系统。最近，我们调整并验证了用于这些动物的慢性不可预测轻度压力(CUMS)方案，其特征反映了在MDD患者中观察到的抑郁样行为、压力源和生物学变化。据研究CUMS猴范式可能是研究肠道微生物群在MDD发病机制中作用的新模型。
本研究利用16S核糖体RNA(rRNA)基因测序比较了CUMS食蟹猴和健康对照的大肠粘膜和肠腔微生物组的生物地理学，并计算了区别扩增子序列变异(ASVs)与抑郁样行为之间的关系。然后，基于ASVs的相对丰度，通过共现分析构建了这些动物的关键共变网络。最后，计算了粘膜和管腔中预测的微生物群落功能，并通过靶向代谢组学分析验证了关键代谢途径中的代谢物。
详细的行为学实验结果以前报道过。简而言之，在55天内暴露于多重不可预测的轻度应激源5个周期后，我们得知，CUMS动物出现显著的高频率和长时间的蜷缩姿势(图1A)，以及较低频率和较短的运动维持的时间(图1B)。此外，在苹果尝试试验（AAT）(图1C)中，CUMS动物明显更少尝试吃苹果(图1C)，而在人类入侵试验（HIT）(图1D)中明显表现出焦虑行为(图1D)。这些发现表明，CUMS组动物表现出抑郁样行为。
图2. CUMS组与CON组微生物组成比较。A 维恩图显示了CUMS和对照组的粘膜和肠腔微生物群ASV丰富度和重叠。B维恩图描绘了CUMS组（左）和对照组（右）的粘膜微生物群ASV丰富度和重叠。C 维恩图显示了CUMS组（左）和对照组（右）的肠腔微生物群ASV丰富度和重叠。D 科水平的10个食蟹猴肠粘膜(左)、肠腔（右）盲肠(CE)、升结肠(AC)、横结肠(TC)和降结肠(DC)的微生物相对丰度。
图3. CUMS组和CON组的歧视性ASVs，以及歧视性ASVs与抑郁样行为的关系。A在门和科水平CUMS猴上调的ASVs饼状图。B 在门和科水平CUMS猴下调的ASVs饼状图。C 维恩图显示了粘膜和管腔中上调的差异性ASVs的重叠。D 维恩图显示了粘膜和管腔中下调的差异性ASVs的重叠。E抑郁行为与粘膜的盲肠(MCE)、升结肠(MAC)、横结肠(MTC)、降结肠(MDC)以及管腔盲肠(LCE)、升结肠(LAC)、横结肠(LTC)和降结肠(LDC)差异性ASVs的相关性。
四种共现网络分析解释了盲肠、升结肠、横结肠和降结肠中差异性ASVs的共变情况(图4)。总体而言，差异性ASVs显示出相对复杂和多样化的共变网络，绝大多数差异性ASVs显著正相关。粘膜和管腔内的差异性ASVs均属于厚壁菌门和细菌门。
最重要的是，厚壁菌门和细菌门在盲肠和结肠中形成了特有的协变网络。例如，在降结肠管腔中，厚壁菌门中9个管腔特异性差异ASVs (ASV29、75、526、567、593、596、914、957、1227)和拟杆菌门中4个差异ASVs (ASV31、516、750、1484)为正相关，厚壁菌门(ASV114和1068)的粘膜特异性ASVs和拟杆菌门(ASV408和729)也与呈正相关。
图4. 反映CUMS组和CON组在盲肠、升结肠、横结肠和降结肠内微生物变化的共现网络。红点表示与对照组相比CUMS组的ASVs富集;蓝点表示相对于对照组，CUMS组ASVs减少;对门级注释的ASVs进行了分析。点之间的边代表Spearman’s相关(正:淡红色;负:浅蓝色)，边缘厚度表示相关值(r)。5CUMS动物体内微生物与碳水化合物和能量代谢途径的相关性
应用PICRUSt (LDA 2, p值 0.05)发现，在粘膜中，CUMS组和对照组共有27个不同的微生物群功能，其中13个在CUMS组中富集，14个在对照组中富集(图5A)。然而，在对照组中只富集了柠檬酸循环(TCA循环)(图5B)。粘膜中主要涉及6种糖类和3种能量代谢途径，包括氨基糖和核苷酸糖代谢(ko00520)、果糖和甘醇糖代谢(ko00051)、戊糖磷酸代谢(ko00030)、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化(ko00040)、乙醛酸和二羧酸的代谢(ko00630)、柠檬酸循环(TCA循环)(ko00020)、光合生物的碳固定(ko00710)、硫代谢(ko00920)和氮代谢(ko00910)。
接下来，通过靶向代谢组学测定肠腔内容物中6种碳水化合物和3种能量代谢途径在内的34种代谢物含量(表S1)。共鉴定出27种代谢产物，其中9种代谢产物(D -葡萄糖、果糖1,6-二磷酸、l -丙氨酸、柠檬酸、酒石酸、草酸、甘油酸、甘油酸、羟丙酮酸、琥珀酸)在CUMS动物体内近乎耗尽(图5C)，其余18个代谢物无显著改变(图S4)。
图5. 在管腔和粘膜鉴别不同的ASVs的改变和预测的群落功能。A 粘膜CUMS(红色)和对照(绿色)组间预测群落功能的动态变化。B 肠腔CUMS(红色)和CON(绿色)组间预测群落功能的动态变化。C碳水化合物和能量代谢途径中9种CUMS动物体内耗尽代谢物的相互作用简图。
越来越多的证据说明，肠道微生物组组成和功能的改变可能与抑郁症的病理有关，但很少有研究关注肠道粘膜和肠腔微生物组。在本研究中，我们观察到具有抑郁样行为的CUMS动物粘膜和肠腔共变ASVs的变化具有不一样的特征，在门水平上主要属于厚壁菌门和拟杆菌门，在科水平上主要属于Prevotellaceae和Lachnospiraceae。
此外，肠道微生物组成的改变与抑郁样行为表型(蜷缩姿势)高度相关。在CUMS动物体内，共预测出来6个碳水化合物代谢途径和3个能量代谢途径发生改变，9个涉及这些代谢途径的代谢物在CUMS动物体内被耗尽，这与PICRUSt分析相一致。本研究示意图见图6，这是首例在食蟹猴胃肠道多个部位展开的关于微生物组成和代谢功能与抑郁症行为的研究。
图6. 本研究示意图。具有抑郁样行为的食蟹猴在盲肠、升结肠、横结肠和降结肠的粘膜和肠腔内共变ASVs的不同特征，科水平上主要属于Prevotellaceae和Lachnospiraceae。具有抑郁行为的食蟹猴的碳水化合物和能量代谢也减少。
之前的临床研究已经证实，MDD患者的粪便微生物组发生改变。然而，由于样本招募、测序和统计方法的不同，不同的研究结果出现了差异。总体而言，在门水平上，最显著的差异菌群是厚壁菌门和细菌门，且抗抑郁药物医治后可恢复。在科水平上，Lachnospiraceae在MDD和健康对照(HCs)之间有差异，但研究结果不一致。例如，我们组报道Lachnospiraceae在MDD患者中上调，而Naseribafrouei等人报道该家族下调。此外，MDD的特征是Prevotellaceae科的丰度减少。在属水平上，MDD和HCs中Alistipes和Oscillibacter在内的许多属存在非常明显差异。此外，在我们组最近的一项研究中发现，粪球菌属和Dialister是区分MDD和双相情感障碍的两种微生物标志物。与临床结果一致的是，食蟹猴在CUMS应激后的粘膜和肠腔内微生物组成与对照有显著差异，在门水平上表现为厚壁菌门和拟杆菌门的改变，在科水平上表现为Prevotellaceae和Lachnospiraceae的改变。与此相一致，经历社会应激的猕猴也发现了微生物组成的显著变化，主要为厚壁菌门。有趣的是，在本研究中，属于乳酸菌属的ASV28在整个大肠粘膜和肠腔部位明显降低。在最近发表的meta分析中也有类似的结果，MDD患者中乳酸菌属丰度较低，这也与啮齿类动物应激相关文献一致。此外，乳酸菌对MDD患者潜在的抗抑郁作用已有文献记载。
因此，无论是人类粪便样本，还是动物粘膜和肠腔样本都一致表明，厚壁菌门和拟杆菌门的微生物组成紊乱可能是抑郁症的一个标志。
肠道微生物对维持人体稳态具备极其重大意义，而肠道微生物的失调可能会引起宿主的发病。重度抑郁症和双相情感障碍(BD)患者粪便微生物的协变网络之前报道过。在MDD中，正相关网络主要存在于拟杆菌门和拟杆菌科的操作分类单元(OTUs)。在BD中，相关网络相对复杂多样，在科水平上主要分布在Prevotellaceae科的OTUs中，在门水平上也分布在拟杆菌门中。与此一致的是，具有抑郁样行为的动物在差异协变ASVs之间有正相关网络， ASVs主要归属于盲肠和结肠的厚壁菌门和细菌门。
这些发现表明，所有这些差异性ASVs可能在抑郁症的大肠微生物环境中发挥协同作用，而厚壁菌门和拟杆菌门是抑郁症肠道ECO的标志。抑郁症肠道微生物群相关的潜在发病机制可能是由于微生物ECO的广泛性的改变，而不单单是单一的肠道微生物。
已经证明，宿主的代谢途径可以被粘膜和肠腔微生物重塑。在人类和猴等健康哺乳动物的中，已经发现粘膜和肠腔微生物的功能。粘膜和管腔的微生物组成对能量和免疫以及维持肠上皮细胞和微生物之间的稳态都有较好的推动作用。近年来，有证据说明，粘膜相关微生物组与胃肠道疾病如克罗恩病、肝硬化、大肠癌的发病机制有关，也与焦虑、卒中的发病机制有关。此外，这些粘膜中肠道微生物组成改变的特征可能是特定部位的，而在粪便样本中检测不到。与之前的研究类似，这项研究揭示了粘膜和肠腔相关微生物组的群落功能在抑郁样行为的病理中发挥了及其重要的作用。其中，预测大肠粘膜出现碳水化合物和能量代谢的改变，大肠肠腔有同样属于碳水化合物代谢的柠檬酸循环(TCA循环)发生改变。在CUMS动物中证实了涉及这些碳水化合物和能量途径的9种耗竭代谢物。这些发现可以用厚壁菌门和拟杆菌门的紊乱来解释，这两菌门慢慢的变成了宿主碳水化合物和能量代谢的关键调节者。在伴发抑郁的肠易激综合征患者中，血浆碳水化合物代谢物与肠道细菌改变相关。此外，在碳水化合物代谢中起关键作用的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)已被证实是参与MDD生物学机制的一个因子。早在1984年，就在MDD患者的脑脊液和血液中发现了显著的能量代谢改变，在最近的啮齿动物和NHP抑郁模型中也发现了。此外，在长期反常睡眠剥夺后，具有抑郁样行为的大鼠能量代谢和微生物组持续发生变化。
本研究发现，具有抑郁样行为的CUMS猴具有粘膜碳水化合物和能量代谢改变的特征，这可能为MDD的发病机制提供了新的认识。
首先，本研究中食蟹猴的样本量比较小;这样的一个问题通过配对设计得到了缓解。此外，我们的结果与之前研究中在CUMS和对照猴中发现的类抑郁行为的结果一致。我们提议进一步进行更大样本的纵向研究，通过将数据划分为更大样本的训练和测试数据来验证我们的发现。
其次，为减少月经周期的干扰，本研究只纳入雄性动物：还要进一步研究以确定这些结果是否适用于雌性动物。
第三，由于代谢组学分析结果不可避免地会被宿主肠道上皮细胞改变，因此没有将靶向代谢组学分析应用于粘膜样本。为了尽最大可能避免宿主的影响，应进行进一步的鸟枪法宏基因组学研究。
第四，在本研究中，食蟹猴的肠道菌群和代谢可能受到禁食或缺水的影响。然而，这些应激源是CUMS中最常见和最重要的成分。因此，我们降低了这些压力源的密度，以最小化潜在的影响。最后，由于在禁食后和安乐死前很难获得小肠内腔样本，因此没有采集小肠样本，本研究主要关注抑郁症患者粘膜和内腔微生物组的差异。
总之，利用非人类灵长类动物抑郁模型,我们得知有抑郁行为的CUMS猴粘膜和肠腔的微生物组成的差异性ASVs，在门水平主要是厚壁菌门和拟杆菌门，在科的水平主要是Prevotellaceae和Lachnospiraceae。此外，预测的微生物群落功能变化主要涉及碳水化合物和能量代谢途径，而在CUMS动物中，参与这些途径的9种代谢物耗竭。这些发现通过鉴定导致抑郁样状态的代谢改变途径，促进了我们对粘膜和肠腔内微生物组怎么样影响抑郁的病理生理学机制的理解。